С 2012, когда соавтор исследования Дженнифер Дудна, преподаватель молекулярных и цитобиологии и химии в УКЕ Беркли и коллеге Эмманюэль Шарпантье, Института Макса Планка Биологии Инфекции, повторно ставила целью белок Cas9, чтобы создать дешевого, точного и простого в использовании генного редактора, исследователи надеялись, что методы лечения на основе CRISPR-Cas9 однажды коренным образом изменили бы лечение генетических заболеваний. Все же развитие лечения генетических заболеваний остается сложной задачей в медицине. Это вызвано тем, что большинство генетических заболеваний может быть вылечено, только если вызывающая болезнь генная мутация исправлена назад к нормальной последовательности, и это невозможно сделать с обычной терапией.CRISPR/Cas9, однако, может исправить генные мутации при сокращении видоизмененной ДНК и вызове направленного на соответствие ремонта ДНК.
Однако стратегии того, чтобы безопасно предоставить необходимые компоненты (Cas9, ведите РНК, которая направляет Cas9 к определенному гену, и ДНК дарителя) в клетки должен быть развит, прежде чем потенциал CRISPR-Cas9-based терапии может быть реализован. Общая техника, чтобы поставить CRISPR-Cas9 в клетки нанимает вирусы, но у той техники есть много осложнений.
CRISPR-золоту не нужны вирусы.В новом исследовании лидерство исследования лабораториями преподавателей биоинженерии Беркли Нирена Мерти и Ирины Конбой продемонстрировало, что их новый подход, названный CRISPR-золотом, потому что золотые наночастицы – ключевой компонент, может поставить Cas9 – белок, который связывает и режет ДНК – наряду с РНК руководства и ДНК дарителя в клетки живого организма, чтобы зафиксировать генную мутацию.«CRISPR-золото – первый пример средства доставки, которое может поставить, все компоненты CRISPR должны были исправить генные мутации без использования вирусов», сказал Мерти.
Исследование было опубликовано 2 октября в журнале Nature Biomedical Engineering.CRISPR-золото восстанавливает мутации ДНК посредством процесса, названного направленным на соответствие ремонтом. Ученые изо всех сил пытались развивать направленную на соответствие основанную на ремонте терапию, потому что они требуют деятельности в том же самом месте и время как белок Cas9, руководство РНК, которое признает, что мутация и ДНК дарителя исправляют мутацию.Чтобы преодолеть эти проблемы, ученые Беркли изобрели судно доставки, которое связывает все эти компоненты, и затем освобождает их, когда судно в большом разнообразии типов клетки, вызывание соответствия направило ремонт.
Золотые наночастицы CRISPR-золота покрывают ДНК дарителя и также связывают Cas9. Когда введено в мышей, их камеры признают маркер в CRISPR-золоте и затем импортируют судно доставки. Затем через серию клеточных механизмов CRISPR-золото выпущено в цитоплазму клеток и разбивается, быстро выпуская ДНК дарителя и Cas9.Единственная инъекция CRISPR-золота в мышечную ткань мышей, что мышечная дистрофия модели Duchenne восстановила 5,4 процентов dystrophin гена, который вызывает болезнь, к дикой местности – тип, или нормальный, последовательность.
Этот темп исправления был приблизительно в 18 раз выше, чем у мышей, отнесся с Cas9 и ДНК дарителя собой, которые испытали только темп исправления на 0,3 процента.Значительно, авторы исследования отмечают, CRISPR-золото искренне восстановило нормальную последовательность dystrophin, который является существенным улучшением, законченным, ранее издал подходы, которые только удалили дефектную часть гена, делая его короче и преобразования одной болезни в другого, более легкой болезни.
CRISPR-золото также смогло уменьшить фиброз ткани – признак болезней, где мышцы не функционируют правильно – и увеличенная сила и гибкость у мышей с мышечной дистрофией Duchenne. Мыши CRISPR-Gold-treated показали двойное увеличение в висящее время в общем тесте на силу мыши и гибкость, по сравнению с мышами, введенными с контролем.
«Эти эксперименты предполагают, что будет возможно развивать невирусную терапию CRISPR, которая может безопасно исправить генные мутации, через процесс направленного на соответствие ремонта, просто развивая наночастицы, которые могут одновременно заключить в капсулу все компоненты CRISPR», сказал Мерти.Исследование нашло, что подход CRISPR-золота к доставке белка Cas9 более безопасен, чем вирусная доставка CRISPR, который, в дополнение к токсичности, усиливает побочные эффекты Cas9 посредством непрерывного выражения этого сокращающего ДНК фермента. Когда исследовательская группа проверила редактирующую ген способность CRISPR-золота у мышей, они нашли, что CRISPR-золото эффективно исправило мутацию ДНК, которая вызывает мышечную дистрофию Duchenne с минимальным сопутствующим повреждением ДНК.
Исследователи определили количество нецелевого повреждения ДНК CRISPR-золота и сочли уровни повреждения подобными той из типичной ошибки упорядочивающего ДНК в типичной клетке, которая не была выставлена CRISPR (0.005 – 0,2 процента). Чтобы проверить на возможную иммуногенность, профили цитокина кровотока мышей были проанализированы 24 часа и спустя две недели после CRISPR-золотой инъекции. CRISPR-золото не вызвало острое-регулирование подстрекательских цитокинов в плазме после многократных инъекций или потери веса, предположив, что CRISPR-золото может использоваться многократно безопасно, и что у этого есть высокое терапевтическое окно для генного редактирования в мышечной ткани.
«CRISPR-золото и, более широко, CRISPR-наночастицы открывают новый путь к более безопасной, доставке, которой точно управляют, генных инструментов редактирования», сказал Конбой. «В конечном счете эти методы могли быть развиты в новое лекарство для лечения мышечной дистрофии Duchenne и многих других генетических заболеваний».Клиническое испытание будет необходимо, чтобы различить, является ли CRISPR-золото эффективным лечением генетических заболеваний в людях. Исследование создает в соавторстве Кунву Ли, и парк Hyo Min создали компанию по запуску, GenEdit (у Murthy есть доля собственности в GenEdit), который сосредоточен на переводе CRISPR-золотой технологии в людей. Лаборатории Murthy и Conboy также работают над следующим поколением частиц, которые могут поставить CRISPR в ткани от кровотока и предпочтительно предназначались бы для взрослых стволовых клеток, которые считают лучшими целями генного исправления, потому что стволовые клетки и клетки – предшественники способны к генному редактированию, самовозобновлению и дифференцированию.
«Генетические заболевания вызывают разрушительные уровни смертности и заболеваемости, и новые стратегии рассмотрения их значительно необходимы», сказал Мерти. «CRISPR-золото смогло исправить вызывающие болезнь генные мутации в естественных условиях, через невирусную доставку белка Cas9, вести РНК и ДНК дарителя, и поэтому имеет потенциал, чтобы развиваться в терапевтическое для того, чтобы лечить генетические заболевания».