«Просто, сокращая длину региона планирования gRNA, мы видели сокращения частот нежелательных мутаций на всех ранее известных нецелевых местах, которые мы исследовали», говорит Дж. Кит Джунг, Мэриленд, доктор философии, объединенный руководитель для Исследования в Отделе MGH Патологии и ведущем авторе отчета. «Некоторые места показали уменьшения в частоте мутации 5,000-кратных или больше, по сравнению с полным gRNAs, и значительно этими усеченными gRNAs – который мы называем, tru-gRNAs – так же эффективны как gRNAs во всю длину при достижении их намеченных целевых сегментов ДНК».Объединение CRISPR-Cas RGNs сокращающий ген фермент по имени Cas9 с коротким сегментом РНК и используется, чтобы вызвать перерывы в дополнительном сегменте ДНК, чтобы ввести генетические изменения. В прошлом году команда Джунга сообщила об открытии, что в клетках человека CRISPR-Cas RGNs мог также вызвать мутации в последовательностях ДНК с различиями до пяти нуклеотидов от цели, которая могла серьезно ограничить клиническую полноценность белков.
Команда развила те результаты, исследовав гипотезу, которая могла казаться парадоксальной, то сокращение gRNA сегмента могло бы уменьшить нецелевые мутации.«Некоторые наши эксперименты с прошлого года предположили, что можно было не соответствовать нескольким нуклеотидам в одном конце gRNA региона взаимозависимости, не затрагивая деятельность планирования», объясняет Джунг. «Это принудило нас задаваться вопросом, могло ли бы удаление этих нуклеотидов сделать систему более чувствительной к несоответствиям в остающейся последовательности».На основе естественной системы разновидность использования бактерий против других болезнетворных микроорганизмов CRISPR-Cas RGNs, наиболее широко используемый исследователями, включает регион планирования с 20 нуклеотидами в gRNA. Чтобы проверить их теорию, команда MGH построила RGNs с прогрессивно короче gRNAs и нашла, что, в то время как gRNAs с планированием для сегментов 17 или 18 нуклеотидов были как или более эффективны, чем gRNAs во всю длину в достижении их целей, те с 15-или сегменты планирования с 16 нуклеотидами уменьшили или никакая деятельность планирования.
Последующие эксперименты нашли, что усеченный RGNs с 17 нуклеотидами эффективно вызвал желаемые мутации в клетках человека со значительно уменьшенными или необнаружимыми нецелевыми эффектами, даже на местах только с одним или двумя несоответствиями.«В то время как мы не полностью понимаем механизм, которым tru-gRNAs уменьшают нецелевые эффекты, наша гипотеза – то, что у оригинальной системы могло бы быть больше энергии, чем этому нужно, позволяя ему расколоть даже недостаточно хорошо подобранные места», говорит Джунг, который является адъюнкт-профессором Патологии в Медицинской школе Гарварда. «Сокращая gRNA, мы можем уменьшить энергию до уровня, просто достаточного для деятельности на цели, делая нуклеазу менее способной расколоть нецелевые места.
Но больше работы необходимо, чтобы определить точно, почему tru-gRNAs уменьшили нецелевые эффекты».