Это новое заявление на редактирующую ген систему CRISPR/Cas9 должно позволить ученым более легко определять функцию отдельных генов, по словам Фэн Чжана, профессора профессионального развития В.М. Кека в Биоинженерии в Отделах MIT и Биологической Разработки Мозговой и Когнитивистики и члене Широкого Института и Института Макговерна MIT Мозгового Исследования.
Этот подход также позволяет быстрые функциональные экраны всего генома, позволяя ученым определить, что гены включили в особенности болезни. В исследовании, опубликованном в выпуске онлайн 10 декабря Природы, Чжан и коллеги определили несколько генов, которые помогают клеткам меланомы стать стойкими к лекарству от рака.
Сильвана Конерман, аспирант в лаборатории Чжана, и Марк Бригам, Институт Макговерна postdoc, являются ведущими авторами газеты.Новая функция для CRISPRСистема CRISPR полагается на клеточное оборудование что использование бактерий, чтобы защитить себя от вирусной инфекции.
Исследователи ранее использовали эту клеточную систему, чтобы создать редактирующие ген комплексы, которые включают сокращающий ДНК фермент по имени Cas9, связанный с коротким берегом руководства РНК, который запрограммирован, чтобы связать с определенной последовательностью генома, говоря Cas9, где сделать его сокращение.За прошлые два года ученые развивали Cas9 как инструмент для того, чтобы выключить гены или заменить их различной версией. В новом исследовании Чжан и коллеги спроектировали систему Cas9, чтобы включить гены, вместо того, чтобы вывести из строя их.
Ученые попытались сделать это перед использованием белков, которые индивидуально спроектированы, чтобы предназначаться для ДНК на определенных местах. Однако эти белки трудные работать с. «Если Вы используете старшее поколение инструментов, заставляя технологию сделать то, что Вы на самом деле хотите, проект самостоятельно», говорит Конерман. «Это занимает много времени и также довольно дорого».
Также были попытки использовать CRISPR, чтобы включить гены, инактивировав часть фермента Cas9, который режет ДНК и соединение Cas9 к частям белков, названных областями активации. Эти области принимают на работу клеточное оборудование, необходимое, чтобы начать читать копирование РНК от ДНК, процесс, известный как транскрипция.Однако эти усилия были неспособны последовательно включить транскрипцию генов.
Чжан и его коллеги, Озэму Нуреки и Хироши Нишимэзу в Токийском университете, решили перестроить систему CRISPR-Cas9 на основе анализа, который они издали ранее в этом году структуры, сформированной, когда Cas9 связывает с РНК руководства и ее целевой ДНК. «На основе знания его 3D формы мы можем думать о том, как рационально улучшить систему», говорит Чжан.В предыдущих усилиях ученые попытались приложить области активации к любому концу белка Cas9 с ограниченным успехом. От их структурных исследований команда MIT поняла, что две маленьких петли руководства РНК тыкают из комплекса Cas9 и могли быть лучшими точками крепления, потому что они позволяют областям активации иметь больше гибкости в пополнении оборудования для транскрипции.
Используя их обновляемую систему, исследователи активировали приблизительно дюжину генов, которые оказались трудными или невозможными включить использование предыдущего поколения активаторов Cas9. Каждый ген показал, по крайней мере, двойное повышение транскрипции, и для многих генов, исследователи нашли многократное увеличение порядков величины активации.Показ активации масштаба геномаКак только исследователи показали, что система была эффективной при активации генов, они создали библиотеку 70 290 РНК руководства, предназначающихся для всех этих больше чем 20 000 генов в геноме человека.
Они проверили эту библиотеку, чтобы определить гены, которые присуждают устойчивость к лекарству от меланомы под названием PLX-4720. Этот препарат worksDrugs этого типа работает хорошо в пациентах, у клеток меланомы которых есть мутация в гене BRAF, но раковые клетки, которые переживают лечение, могут превратиться в новые опухоли, позволив раку рецидивировать.Чтобы обнаружить гены, которые помогают клеткам стать стойкими, исследователи поставили компоненты CRISPR значительной части населения клеток меланомы, выращенных в лаборатории с каждой клеткой, получающей различную РНК руководства, предназначающуюся для различного гена.
После рассмотрения клеток с PLX-4720 они определили несколько генов, которые помогли клеткам выжить – некоторые, которые, как ранее известно, были вовлечены в устойчивость к лекарству, а также несколько новых целей.Исследования как это могли помочь исследователям обнаружить новые лекарства от рака, которые препятствуют тому, чтобы опухоли стали стойкими.
«Вы могли начать с препарата, который предназначается для видоизмененного BRAF наряду с комбинированной терапией, которая предназначается для генов, которые позволяют клетке выживать. Если Вы нацелены на них обоих в то же время, Вы могли бы, вероятно, препятствовать тому, чтобы клетки разработали механизмы сопротивления, которые позволяют дальнейший рост несмотря на медикаментозное лечение», говорит Конерман.
Ученые попытались сделать крупномасштабные экраны как это, поставив единственные гены, которые несут вирусы, но это не работает со всеми генами.Лаборатория Чжана также планирует использовать эту технику, чтобы проверить на гены, которые, когда активировано, могли исправить эффекты аутизма или нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера. Он также планирует сделать необходимые реактивы доступными для академических лабораторий, которые хотят использовать их через хранилище Addgene.
Исследование финансировалось Национальным Институтом Психического здоровья; Национальный Институт Неврологических расстройств и Удара; Keck, Ученые Сирла, Клингенштайн, Vallee и фонды Simons; и Боб Меткалф.