Большая часть работы систем CRISPR/Cas9, создавая «разрывы двойного берега» (DSBs) в областях генома, предназначенного для редактирования или для удаления, но многих исследователей, настроена против создания таких перерывов в ДНК живущих людей. Как доказательство понятия, группа Salk использовала их новый подход, чтобы лечить несколько заболеваний, включая диабет, острую болезнь почек и мышечную дистрофию, в моделях мыши.
«Хотя много исследований продемонстрировали, что CRISPR/Cas9 может быть применен как мощный инструмент для генотерапии, есть возрастающее беспокойство относительно нежелательных мутаций, произведенных двойным берегом, прорывается через эту технологию», говорит Хуан Карлос Исписуа Бельмонте, преподаватель в Лаборатории Экспрессии гена Солка и ведущий автор новой работы, опубликованной в Клетке 7 декабря 2017. «Мы смогли обойти то беспокойство».В оригинальной системе CRISPR/Cas9 фермент Cas9 вместе с РНК руководства, которые предназначаются для него к правильному пятну в геноме, чтобы создать DSBs.
Недавно, некоторые исследователи начали использовать «мертвую» форму Cas9 (dCas9), который может все еще предназначаться для определенных мест в геноме, но больше не режет ДНК. Вместо этого dCas9 был вместе с транскрипционными областями активации – молекулярными выключателями – которые включают целенаправленные гены. Но получающийся белок – dCas9 приложенный к выключателям активатора – слишком большой и большой, чтобы вписаться в транспортное средство, как правило, раньше поставлял эти виды методов лечения к клеткам в живых организмах, а именно, adeno-связанные вирусы (AAVs).
Отсутствие эффективной системы доставки делает очень трудным использовать этот инструмент в клинических заявлениях.Команда Изпизюы Бельмонте объединила Cas9/dCas9 с диапазоном различных выключателей активатора, чтобы раскрыть комбинацию, которая работала, даже когда белки не были сплавлены друг другу.
Другими словами, Cas9 или dCas9 были упакованы в один AAV, и выключатели и РНК руководства были упакованы в другого. Они также оптимизировали РНК руководства, чтобы удостовериться, что все части закончились в желаемом месте в геноме, и что целенаправленный ген был сильно активирован.«Компоненты, все сотрудничают в организме, чтобы влиять на эндогенные гены», говорит Хсин-Кай (Кен) Ляо, исследователь штата в лаборатории Изпизюы Бельмонте и co-first автор новой статьи. Таким образом технология работает эпигенетическим образом, означая, что она влияет на активность гена, не изменяя последовательность ДНК.
Чтобы проверить метод, исследователи использовали модели мыши острого повреждения почки, диабета 1 типа и формы мышечной дистрофии. В каждом случае они спроектировали свою систему CRISPR/Cas9, чтобы повысить выражение эндогенного гена, который мог потенциально полностью изменить симптомы болезни.
В случае болезни почек они активировали два гена, которые, как известно, были вовлечены в функцию почек и наблюдаться не только увеличенные уровни белков, связанных с теми генами, но улучшенная функция почек после острой травмы. Для диабета 1 типа они стремились повышать деятельность генов, которые могли произвести производящие инсулин клетки. Еще раз лечение работало, понижая уровни глюкозы крови в модели мыши диабета.
Для мышечной дистрофии исследователи выразили гены, которые, как ранее показывали, полностью изменяли симптомы болезни, включая один особенно большой ген, который не может легко быть поставлен через традиционные установленные вирусом генотерапии.«Мы были очень взволнованы, когда мы видели результаты у мышей», добавляет Фумиюки Хэйтанэка, научный сотрудник в лаборатории и co-first автор статьи. «Мы можем вызвать активацию генов и в то же время видеть физиологические изменения».Команда Изпизюы Бельмонте теперь работает, чтобы улучшить специфику их системы и применить его к большему количеству типов клетки и органов, чтобы рассматривать более широкий диапазон человеческих болезней, а также омолодить определенные органы и полностью изменить процесс старения и возрастные условия, такие как потеря слуха и дегенерация желтого пятна.
Больше испытаний на безопасность будет необходимо перед испытаниями на людях говорят они.